Coloración de Ziehl-Neelsen
Los microorganismos del género Mycobacterium son bacilos, que en algún
momento de su ciclo biológico tienen la capacidad de ser ácido-resistentes.
Esto se debe a la presencia de componentes lipídicos únicos en la superficie de
la micobacteria conocidos como ácidos micólicos, y se encuentran solamente en
este género. Se usa una mezcla de fucsina fenicada (mezcla de fucsina básica y
fenol) en el procedimiento de tinción, usando calentamiento lento y progresivo
para conseguir que el colorante penetre en las células. Una vez lavada con agua
destilada, la preparación se decolora con ácido y alcohol; después de otro
lavado, se hace una coloración final con azul de metileno. Las bacterias ácido
resistentes aparecen de color rojo, mientras que el fondo de la preparación y
las bacterias no ácido resistentes se ven de color azul
El componente responsable de este
comportamiento es el ácido micólico el cual es un hidroxilípido de cadena larga
y ramificada. La reactividad radica en el grupo carboxilo que posee, el cual
reacciona con el ión amonio de la fucsina, de forma eventual estos lípidos se
unen al péptido glucano de la pared celular con lo que esta adquiere una
consistencia lipídica. Las micobacterias no pueden ser coloreadas por el método
de Gram debido a este material lipídico, si el lípido se extrae con etanol las
células ya no serán más ácido-resistentes sino grampositivas normales
Se requiere un tratamiento
especial para que el colorante primario (fucsina fenicada) pueda atravesar el
material céreo de los bacilos ácido-resistentes (BAR). La técnica convencional de
Ziehl- Neelsen utiliza calor (coloración en caliente), esto es necesario para
que el colorante atraviese la pared bacteriana que posee ceras. Cuando se
suspende en calentamiento y se enfría con agua, se produce una nueva
solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir
de las bacterias. El calentamiento es capaz de aumentar la energía cinética de
las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias
Otro procedimiento es la
modificación de Kinyoun el cual se denomina método en frio porque utiliza un
detergente activo de superficie, como tergitol, en vez de calor. Usa un decolorante
más débil ácido sulfúrico (H2SO4 al 0,5 – 1%) en lugar de
alcohol ácido al tres por ciento. Es útil para diferenciar entre organismos que
son débiles o parcialmente ácido resistentes, en especial, Nocardia sp.
Procedimiento de la tinción de Ziehl- Neelsen
1. Elabore un extendido.
2. Fijar el extendido usando una plancha de calentamiento a 60°C por diez minutos como mínimo; y dos horas como máximo.
3. Colocar un papel de filtro sobre el portaobjetos con el extendido y ubicar sobre un soporte para la coloración, este paso se puede descartar si el colorante está recién filtrado.
4. Cubrir la preparación con fucsina fenicada, calentar a la llama de un mechero por debajo del portaobjetos por cinco a diez minutos hasta obtener la emisión de vapor (tres veces). El calor actúa como mordiente. Evitar que la lámina se seque, agregar más colorante si es necesario.
5. Retirar el papel de filtro (usando una pinza) y lavar el portaobjetos con agua hasta que el colorante deje de salir.
6. Cubra el portaobjetos con alcohol-ácido (solución decolorante) por un minuto. Decolorar hasta que quede una traza de color rosado.
7. Lavar con agua y eliminar el exceso.
8. Cubrir la lámina con azul de metileno (colorante de contraste) por uno o dos minutos.
9. Lavar con agua corriente. Escurrir y secar al aire. No usar papel absorbente.
10. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión (100X).
Las bacterias ácido-resistentes se verán de
color rojo intenso; mientras que otros elementos celulares y microorganismos no
ácido-resistentes, se colorean de azul con el colorante de contraste. Las
micobacterias, de forma frecuente aparecen como bacilos ligeramente curvos que
muestran la propiedad de ácido-resistencia (BAR). Pueden presentar gránulos más
oscuros y dar la impresión de estar fragmentados
Colorantes de Ziehl-Neelsen
Colorante primario (Fucsina fenicada de Ziehl):
La solución uno (I) se prepara disolviendo 0,30
gramos fucsina básica (acetato de pararrosanailina) en diez mililitros de
etanol al 95%. Para la solución dos (II) se disuelven cinco gramos o cinco
mililitros de de cristales de fenol en 95 mililitros de aguas destilada. La
solución de trabajo se obtiene mezclando las soluciones I y II. Se debe dejar en reposo por varios
días antes de usar. Se guarda en frasco ámbar y se debe filtrar antes de
utilizar
Solución decolorante (alcohol-ácido):
Se obtiene disolviendo tres
mililitros de HCl concentrado (ácido clorhídrico) en 97 mililitros de etanol al
95%. Mezclar y conservar en frasco ámbar
Colorante de contraste (azul de metileno):
Se disuelven cero coma treinta gramos de azul de
metileno en cien mililitros de agua destilada. Guardar en frasco ámbar
Bibliografía
Castellano, G. M. J.; Ginestre, P. M. M.; Ávila, R.
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Universidad del Zulia.
Madigan, M. T.;
Martinko, J. M. y Parker, J. (2004). Brock
Biología De Los Microorganismos
(págs. 412, 413). Caracas: Pearson Prentince Hall.
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