Coloración de flagelos
Coloración de flagelos
Los flagelos son estructuras extremadamente finas de 12 a 30
nanómetros de diámetro, para poder verse en el microscopio óptico, sin embargo,
si son tratadas con una suspensión coloidal inestable compuesta por sales de
ácido tánico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los
flagelos, se puede evidenciar su presencia y disposición en las células. De
esta forma, el diámetro aparente de estas estructuras aumenta de tal manera que
a tinción posterior con fucsina básica los hace visibles en el microscopio de
luz
Una gran cantidad de bacterias móviles poseen flagelos, la
disposición de los mismos, su número y forma son claves para la diferenciación
de especies, en especial, cuando las reacciones bioquímicas resultan erróneas o
son débiles. La coloración de flagelos no es un proceso sencillo, los flagelos
son frágiles, por lo general se desprenden de la superficie bacteriana durante
el procesamiento de la muestra. Muchas células en cultivos pueden dejar de
producir flagelos y la tinción puede fracasar en ocasiones
Coloración de Leifson
Esta técnica es empleada de forma muy común, la tinción de
Leifson o una modificación de la misma es un procedimiento sencillo, pero se
debe ejecutar los pasos del procedimiento de forma exacta
Los flagelos de las bacterias pueden ser teñidos empleando
soluciones alcohólicas de rosanilina que forman un precipitado a medida que el
alcohol se va evaporando mientras se realiza la tinción. La fucsina básica
(acetato de pararrosanilina) sirve como tinción primaria, se le agrega ácido
tánico a la solución para que actúe como mordiente. Se puede utilizar una
contra-tinción, como azul de metileno, para ver mejor las bacterias en casos en
los cuales la tinción primaria resulta débil
Procedimiento de la tinción de Leifson
1.
Emplear un cultivo joven en un medio de agar sin
carbohidratos.
2.
Se prepara una suspensión bacteriana que
equivale al tubo número cinco de la escala de McFarland, para ello se utiliza agua
destilada o desionizada estéril.
3.
Colocar dos gotas de la suspensión en el extremo
de una lámina portaobjetos que ha sido tratado con anterioridad con una
solución ácida.
4.
Secar al aire.
5.
Con lápiz graso se traza una línea perpendicular
en la superficie del vidrio en el lado opuesto a la suspensión seca.
6.
Se colocar el portaobjeto sobre una rejilla
inclinada y se cubre la preparación con una capa delgada del colorante de
Leifson. La marca hecha con el lápiz graso evita que el colorante se derrame
del extremo de la lámina.
7.
Colorear de cinco a 15 minutos, permitiendo que
se forme un precipitado mientras se va evaporando el alcohol.
8.
Cuando se forme el precipitado se enjuaga
suavemente con agua destilada.
9.
Escurrir el exceso de agua,
10.
Secar al aire.
11.
Observar con objetivo de inmersión 100X.
Interpretación
Se deben observar flagelos de color rojo a azul-negro.
Nota: los portaobjetos que se utilizan para esta
coloración se deben sumergir en ácido clorhídrico (HCL) concentrado al tres por
ciento en alcohol etílico al 95% por cuatro días. Se lavan con agua corriente (se
deja correr el agua sobre las láminas que han sido colocadas de forma previa en
una jarra de Coplin, por diez minutos), después se enjuaga con varios cambios
de agua destilada. Se colocan los portaobjetos en posición vertical para permitir
que se sequen al aire. De forma inmediata antes de usarlos se pasan por la
llama del mechero
Colorantes de Leifson
Para preparar la solución A (fucsina básica al 1,2 % en
alcohol al 95%) se agregan seis gramos de fucsina básica certificada para
tinción en 50 mililitros de alcohol etílico al 95%. Se añade la fucsina, luego
el alcohol y se agita de 18 a 24 horas con un agitador magnético para disolver
la fucsina. Para la solución B (ácido tánico al tres por ciento en solución acuosa)
se utilizan cero coma treintaisiete gramos de cloruro de sodio (NaCl) más cero
coma setentaicinco gramos de ácido tánico los cuales se diluyen en 50
mililitros de agua destilada. La suspensión de poseer un color amarillo claro para
considerarse satisfactoria. Se debe agregar fenol con una concentración de 1:200
para evitar que aparezcan mohos durante su almacenamiento. Se mezclan con
cuidado las soluciones A y B, se ajusta el pH con hidróxido de sodio (NaOH)
1,0N. Se envasa el colorante en un frasco ámbar bien tapado, refrigerar durante
tres días a cuatro grados centígrados antes de usar con el fin de estabiliza la
solución de trabajo
El colorante de Leifson se puede conservar en durante un mes
en refrigeración y un año o más en congelación. Este colorante se deteriora rápido
a temperatura ambiente. Para el proceso de tinción se debe usar solamente el
sobrenadante claro, no se debe agitar el sedimento que se deposita en el fondo
de la botella. Antes de usar, se debe retira un volumen pequeño de la solución
colorante y permitir que alcance la temperatura ambiente. Descantar la fracción
colorante que pueda sobrar después de teñir
Coloración de Ryu
La tinción de Ryu es muy aconsejable para la observación de
flagelos debido a que es fácil de realizar y da resultados convenientes
Procedimiento de la tinción de
Ryu
1.
Colocar dos gotas de solución salina fisiológica
en un extremo de un portaobjetos que ha sido limpiado de forma meticulosa.
2.
Preparar el extendió a partir de un cultivo
joven en un medio libre de azucares (agar nutritivo, tocando con suavidad el
centro de cada una de las gotas de solución salina fisiológica colocadas con
anterioridad.
3.
Secar las gotas a temperatura ambiente.
4.
Cuando están secos cubrir los extendidos con
colorante de Ryu por uno a cinco minutos.
5.
Remueva el exceso de colorante con agua.
6.
Cuando se sequen los extendidos examinar usando
el objetivo de inmersión comenzando desde la periferia al centro.
Interpretación
Tanto las bacterias como los flagelos de las mismas se tiñen
de color violeta.
Colorantes de Ryu
La solución uno se prepara de con los siguientes reactivos: diez
mililitros de fenol al cinco por ciento, dos gramos de ácido tánico en polvo, diez
mililitros de sulfato de potasio y aluminio saturado con agua (12 H2O)
y 100 mililitros de agua destilada. La solución dos, está compuesta por: 12
gramos de cristal violeta más 100 mililitros de alcohol etílico al 95 por
ciento. La resultante es una solución saturada. Se mezclan diez partes de la
solución uno (mordiente) con una parte de la solución dos y se debe almacenar
en un recipiente de plástico a temperatura ambiente
Bibliografía
Brooks. G. J., Butel.
J. S. y Morse. S. A. (1999). Microbiología médica de Jawetz, Melnick y
Adelberg. México: Manual Moderno. Pag. 42.
Castellano. G. M. J., Ginestre. P. M. M., Avila. R. Y. C.,
Romero. A. S. C. y Perozo. M. A. J. (2012). Manual práctico de
Bacteriología General. Segunda Edición. Maracaibo: Ediciones del
Vicerrectorado Académico. Universidad del Zulia. Pag. 39 - 41.
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